编者按：在南宁召开的第一届中美国际妇女儿童高峰论坛，我们很荣幸的邀请到上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心分子诊断实验室主任王剑教授，针对二代基因测序相关问题接受中国妇产科网的采访。
王剑教授
中国妇产科网：王教授，您好！非常感谢您接受中国妇产科网的采访。在“第一届中美国际妇儿高峰论坛”上，您做了关于下一代测序技术在罕见病分子诊断中的应用的精彩报告，请问您认为目前二代测序相比较传统的基因检测方法，有哪些明显的优势?
王剑教授：下一代测序(Next generation sequencing，NGS)能同时对几十万至几亿的DNA分子进行平行测定，与传统的一代测序技术(Sanger 测序)相比，具有高通量、高敏感性等优势。NGS按测序目标序列的大小可分为全基因组测序(Whole genome sequencing，WGS)和靶向重测序(Targeted resequencing)。靶向重测序又可分为全外显子组测序(Whole exome sequencing，WES)和靶向目标基因测序(Targeted panel sequencing，TPS)。根据不同的实验目的和临床应用需求，可以选择不同实验方法对几十至2万多个基因进行高通量测序。例如在遗传病的诊断和研究中，对于“已知致病基因阴性的病例”，可以通过WES或WGS方法鉴定新的致病基因;对于“表型复杂，临床诊断不清的病例”，可以运用WES或几千个基因的遗传病大panel;而对于那些“诊断相对明确，但致病基因较多的病例”，则完全可以采用经济的小panel。NGS技术在肿瘤和部分遗传病携带者中，可以检测出超低频率的mosaic突变，这体现了该技术的敏感性。另外，从技术应用前景分析，NGS在检测单个或小片段碱基变异(SNVs)的同时，能够检测大片段的拷贝数变异(CNVs)，将来有望逐步取代MLPA和基因芯片等方法。
中国妇产科网：二代测序技术在近年来发展迅速，但同时也存在一定的问题，请问您认为目前二代测序在临床上应用的难点有哪些?
王剑教授：目前NGS正被越来越广泛应用于临床分子诊断中，但也存在许多诸如法律法规、伦理、质量控制等方面的问题，特别是面临着“如何解释海量变异”这一艰巨的任务。以下是现阶段NGS 技术在临床遗传诊断实验室进行推广应用存在的主要问题。
(1)变异解释问题：NGS会产生海量的数据，如何在庞大的数据中分析出可靠、有意义的结果，如何正确、合理解释基因组变异，使之在临床诊疗能够有效应用已成为目前最为棘手的问题。以下任一情况的发生，都将可能导致临床误诊或延误治疗。①错误的将部分“良性”基因或变异归类为“致病性”基因或变异，例如Piton等通过统计正常人群的WES变异数据库，发现以往报道的106个与X连锁智力落后相关的致病基因中至少有25个是有疑问的，需要重新评估其病理意义；②夸大或过度解释部分变异在临床诊疗中的作用，特别是对于疾病“易感基因(或倾向性基因)”的检测等；③由于目前的医学知识对于人类基因组变异导致疾病的病理意义还有一定的局限性(特别是在罕见病中)，且从业人员所掌握的专业知识及经验“良莠不齐”，因此往往会遗漏真正的“致病性”变异。
(2)标准化问题：目前由于各个实验室所采取的建库、富集、测序等实验方法等不同，特别是需要考虑经济成本方面的因素，致使数据质量方面差异较大。另外由于各个临床实验室所涉及的疾病谱差异，对于测序质量的要求也不一致，如检测体细胞突变性疾病需要更高的测序深度。这些因素使各实验室所制定的参数标准不统一，如测序深度、均一性、覆盖度及准确性等。另外由于从业人员知识背景及评判变异病理意义的标准不同，最终导致不同基因检测实验室出具的检测报告大相径庭。
(3)法律法规及伦理问题：基因组测序属于当代前沿技术研究范畴，涉及伦理、隐私和人类遗传资源保护、生物安全等敏感问题。另外由于NGS仪器设备和试剂等都属于近几年分子生物医学领域刚研发的产品，因此医疗机构开展基因诊断服务不可避免需要面临价格、质量监管等问题。
中国妇产科网：目前二代测序产生的大量数据的解读是特别棘手的问题，在报告中您为大家分享了许多精彩的病例以及数据分析过程，能不能为大家分享下您在这方面的一些经验?
王剑教授：随着NGS技术的逐步成熟、费用的降低和实验周期的缩短，产生数据已越来越变得容易。但是如何在大量的数据中寻找到真正与疾病相关的病理性变异，并合理准确的解释其意义，已成为目前最为重要的工作。
对于变异的解读，主要分为生物信息学分析和临床个体化分析两个过程：(1). 生物信息学分析过程：即利用已有的数据库和功能预测软件等，排除人群中良性的变异，寻找出候选致病变异。临床实验室可以选择一些成熟的商品化软件分析系统，并结合自己实验室积累的数据库，建立1~2套独立的pipeline。按照人群频率、功能预测、家系遗传模式、疾病表型等情况设定不同的参数，从而过滤掉绝大多数的“良性”变异，留下一组与疾病表型相关的变异；(2).临床个体化分析过程：尽管电子生物信息学分析pipeline可以帮助缩小变异的范围，但对于大多数病例来说，最后还是留下一组(10~200)变异，这些变异需要结合患者临床表型和查询文献资料等来逐一甄别。就好比警察在茫茫人海中抓犯罪分子，除了运用高科技刑侦手段外，最后还是必须由经验丰富的侦探来抓捕罪犯。因此，这个最后的“抓捕”过程就取决于分析人员对临床遗传学知识所掌握的程度，和对该类疾病表型及致病基因的熟悉程度。
经过多年的基因诊断工作实践和对近千例高通量测序样本的分析经历，我的经验总结如下：(1).详细准确的病史描述对找到致病基因非常重要，因为许多疾病有可能是罕见疑难病例，临床表型不典型，复杂多样，涉及多个临床专业。分析时，需要按照不同的表型词条来搜索相关基因。找到候选基因后，还要将已报道的病例表型与目前患者的病史做一一比对，分析是否符合，必要时调取患者的影像学检查、质谱等检查资料。(2).不同的疾病、不同的基因需要采取个体化的分析策略，随时调整过滤条件参数。例如有些疾病的致病变异在人群中有一定携带率，需要适当提高人群频率过滤值;有的疾病常见变异位于非编码区，不能只关注编码区。(3).建立自己实验室的小型数据库，积累当地人群的基因变异谱，便于过滤掉一些地方人群特有的罕见变异。并加强与国内外其他同行的交流，分享某些疾病的基因变异数据，避免重复的功能验证。(4).更重要的是实验室与临床医生之间必须时刻保持交流互动：当患者表型复杂、不典型，且有多个“可疑”的致病基因时，需要主动联系主诊医生讨论病情后再出诊断报告。部分病例可能需要通过长期的随访观察，历经多次诊断结论的修正。
中国妇产科网：二代测序相关检测的费用问题也是目前大家非常关心的，在这方面您有什么看法么?
王剑教授：高通量测序技术是近几年发展起来的具备高科技含量的技术，仪器设备和试剂等都是各大厂商前期花费巨资研发成功的，因此价格偏高在所难免。尽管这几年呈直线下降趋势，但是相比一些常规诊断设备、试剂价格还是昂贵许多，限制了其在临床应用的范围。相信随着该项技术的不断发展，检测的费用将进一步下降。现阶段从我们医务人员的角度，重点是把握好高通量测序的适应症范围，提高临床诊断功效。即选择最合适、最经济的检测方法，得到最大的临床诊断阳性率。帮助患者花最少的费用，诊断明确疾病。
中国妇产科网：目前精准医疗、转化医学是一个热点话题，您是如何看待精准医疗和转化医学的?
王剑教授：精准医疗和转化医学都是近几年来医学发展史上重要的医学理念和发展方向，其中基因组医学是重要的组成部分。以人类基因组为基础的生命科学和临床医学的革命，将对整个21世纪产生重大社会影响和重大经济效益。我很幸运能够从事遗传学研究和临床基因诊断工作，有机会探索疾病致病机制的同时，积极转化研究成果，帮助患者及家属得到明确的疾病诊断，选择最佳的治疗方案。
专家介绍
王剑 遗传学博士，副研究员，硕士生导师，现为上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心分子诊断实验室主任。目前主要从事遗传性疾病的分子诊断及致病机制研究，曾在美国哈佛大学医学院从事遗传性疾病高通量测序基因组研究，并接受过哈佛医学院临床遗传学培训。近年来在国家自然科学基金面上项目、青年项目等多项科研项目的支持下，对儿童罕见病、出生缺陷等疾病开展了系统的遗传学研究，共计发表SCI论文30余篇，总影响因子>160，代表性论著以第一作者发表于《新英格兰医学杂志》等国际著名期刊。实验室是国内最早开展遗传诊断的专业实验室之一，率先将基因芯片和高通量测序等技术应用于基因检测，能够对4000多种罕见遗传病开展基因诊断。